在芝加哥大學(xué)第五任校長羅伯特·梅納德·哈欽斯（Robert M. Hutchins）在任的24年里，芝加哥大學(xué)經(jīng)歷了許多重大變革。哈欽斯提出了旨在防止學(xué)術(shù)課程和職業(yè)課程過分專門化的“芝加哥計(jì)劃”，對(duì)其他美國大學(xué)的本科通識(shí)教育產(chǎn)生了巨大影響，他建立了沿用至今的本科生核心課程（Common Core），并將研究學(xué)院重組為四個(gè)學(xué)部。 在他的帶領(lǐng)下，芝大平穩(wěn)渡過了美國經(jīng)濟(jì)大蕭條（1929年-1933年）。
第二次世界大戰(zhàn)期間，芝大在曼哈頓計(jì)劃中扮演了重要角色。這一時(shí)期，大批物理學(xué)家聚集芝大，奠定了該校在自然科學(xué)界的地位。
作為曼哈頓計(jì)劃的一部分，由加州大學(xué)伯克利分校化學(xué)家格倫·西奧多·西博格（Glenn T. Seaborg）帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)在芝加哥大學(xué)喬治·赫伯特·瓊斯實(shí)驗(yàn)室（George Herbert Jones Laboratory）于1942年9月首次分離并測量出94號(hào)放射性元素钚；之后，95號(hào)元素镅、96號(hào)元素鋦也在芝大被化學(xué)認(rèn)定。而在1942年12月2日，著名物理學(xué)家恩利克·費(fèi)米及其助手們?cè)谥ゼ痈绱髮W(xué)Stagg Field Stadium內(nèi)建成了世界上第一座可控核反應(yīng)堆，命名為“芝加哥一號(hào)堆” （Chicago Pile-1），成功產(chǎn)生可控的核裂變鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，而這一成就是原子能時(shí)代的一個(gè)重要里程碑，為1945年的原子彈的成功爆炸奠定了基礎(chǔ)，芝加哥大學(xué)也因此被稱為“原子能誕生地”。
20世紀(jì)60年代，隨著美國反戰(zhàn)運(yùn)動(dòng)以及女權(quán)主義的興起，芝大校園內(nèi)的學(xué)生運(yùn)動(dòng)進(jìn)入高潮。1962年，學(xué)生占領(lǐng)校長辦公室以抗議學(xué)校租賃政策。1969年，為抗議學(xué)校開除左翼作家馬琳·迪克森，400名學(xué)生占領(lǐng)行政大樓達(dá)兩周之久。
